Abierto al público desde 1841, ocupa el antiguo Convento de la Merced de la Calzada y está considerado como la segunda pinacoteca de España, después del Museo del Prado de Madrid. Se muestra la trayectoria de la escuela pictórica sevillana, sobre todo la del siglo XVII y se exponen obras de Francisco Pacheco, Alonso Vázquez, Murillo, José de Ribera o Zurbarán entre otros muchos representantes locales. La naturaleza de las colecciones responde a bienes eclesiásticos desamortizados, donaciones particulares y adquisiciones. Como dato curioso, señalar que en este antiguo convento vivió Tirso de Molina, creador del popular personaje Don Juan Tenorio.